HEMATOPOIESE

Vous profiterez de ce document si les réponses aux questions ou affirmations suivantes vous posent des problèmes :

Les cellules souches hématopoïétiques utilisées pour une autogreffe peuvent être recueillies dans la moelle ou dans le sang
Un adulte normal fabrique 2 millions de globules rouges par secondes
Les cellules souches utilisées pour les greffes sont quantifiées par leur morphologie au myélogramme ou à la biopsie ostéomédullaire
Les globules rouges sont-ils capables de se diviser ?
Le myélogramme permet-il de mettre en évidence une myélofibrose de la moelle ?

Définition : L'hématopoïèse est l'ensemble des phénomènes qui concourent à la fabrication et au remplacement continu et régulé des cellules sanguines.

Besoins : Les cellules sanguines sont pour la plupart d'entre elles très différenciées, éléments terminaux et fonctionnels de lignées. Elles n'ont pas ou peu de possibilités de synthèse protéique et de division cellulaire (les hématies et les plaquettes n'ont pas de noyau). Leur durée de vie est courte : quelques heures pour les polynucléaires, quelques jours pour les plaquettes, quelques semaines pour les hématies. Cependant leur nombre est très élevé comme le montre les résultats d'un hémogramme.

L'hématopoïèse assure donc une production quantitativement très importante: chaque jour elle produit environ 10xp13 cellules sanguines. Ceci correspond par exemple à la production de plus de 2 millions d'hématies par seconde.

Cette considérable activité de production est assurée par une petite population de cellules de la moelle osseuse appelées cellules souches hématopoïétiques. Elle doit de plus être contrôlée afin de maintenir à peu près constant le nombre de cellules sanguines malgré des variations de consommation importantes liées à des circonstances pathologiques (hémorragies, infections ...). Cette régulation repose sur des mécanismes cellulaires et humoraux (facteurs de croissance) qui peuvent être stimulateurs ou inhibiteurs de l'hématopoïèse.

Sièges : Le siège de l'hématopoièse varie :

L'hématopoïèse foetale lors de la vie intra-utérine :

s'effectue au niveau du tissu conjonctif embryonnaire jusqu'au 2° mois.
est hépatique et splénique du 2° au 6° mois.
devient médullaire à partir du 4° mois et coïncide avec le développement des ébauches osseuses.

Après la naissance l'hématopoïèse normale est localisée exclusivement dans la moelle osseuse. Jusque l'âge de 5 ans tous les os ont une activité hématopoïétique. Ensuite cette activité va progressivement se limiter au niveau des os courts et plats (sternum, cotes, vertèbres, os iliaques).

Chez les rongeurs la rate et la moelle osseuse ont une activité hématopoïétique. Cette différence avec l'humain est importante pour comprendre et interpréter les nombreuses expériences effectuées sur des souris. Ces études ont permis la mise en évidence et la caractérisation des cellules souches.

Les compartiments de l'hématopoïèse :

Toutes les cellules sanguines (hématies, polynucléaires, monocytes, lymphocytes et plaquettes) sont produites à partir d'une même cellule indifférenciée dite cellule souche totipotente ou cellule souche primitive.

Sous l'influence de facteurs stimulants une cellule souche totipotente va s'engager dans la différenciation d'une lignée cellulaire. Elle devient alors un progéniteur (= cellule souche différenciée ou " engagée ").

Après plusieurs divisions qui aboutissent à des cellules souches engagées à la potentialisation de différenciation de plus en plus limitée, les progéniteurs deviennent spécifiques d'une seule lignée. On aboutit alors aux précurseurs, cellules identifiables morphologiquement sur un prélèvement de moelle osseuse. Ces précurseurs se divisent et maturent. Ils correspondent à la majorité des cellules vues sur un étalement de myélogramme ou sur une biopsie ostéomédullaire (BOM). La maturation terminale aboutit aux cellules matures fonctionnelles qui passent dans le sang.

L'hématopoïèse comporte donc 4 compartiments:

o Les cellules souches totipotentes
o Les progéniteurs
o Les précurseurs
o Les cellules matures

Les cellules souches primitives :

1 - Propriétés:

Les cellules souches ont deux propriétés essentielles: la capacité d'auto-renouvellement et la capacité de différenciation:

o Autorenouvellement = multiplication sans différenciation permettant de maintenir intact un pool de cellules souches primitives et donc le potentiel de l'hématopoïèse.

o Différenciation = possibilité, sous l'influence de facteurs de croissance, de se diviser en s'engageant de façon irréversible vers plusieurs ou une lignée. La cellule perd alors sa totipotence pour devenir une cellule souche engagée.

Lors d'une hématopoïèse normale il existe un équilibre entre la production des cellules souches par division cellulaire (autorenouvellement) et la perte des cellules souches par engagement vers les lignées cellulaires (différenciation).

2 - Mise en évidence chez la souris:

L'existence d'une cellule souche totipotente a été prouvée par l'expérience de Till et Mc Culloch (1961) : L'irradiation (1000 rads) d'une souris détruit son tissu hématopoïétique et induit une aplasie médullaire mortelle en l'absence de greffe de moelle osseuse. Au contraire, si une greffe est réalisée après l'irradiation (injection de quelques ml de moelle d'une souris syngénique) l'animal ne décède pas d'insuffisance médullaire. Vers le 10° jour sa rate est remplie d'amas cellulaires macroscopiques (= colonies). Ces colonies sont mixtes c'est à dire constituées de cellules appartenant à plusieurs lignées cellulaires. Une colonie observée correspondant à une cellules souche injectée. On les appelle CFU-S ("Colony Forming Unit-Spleen").

Toutes les cellules d'une colonie proviennent bien d'une même cellule souche totipotente : ceci est prouvé en répétant la même expérience mais après avoir induit dans les cellules greffées des anomalies chromosomiques variées. Chaque cellule d'une même colonie possède une anomalie chromosomique identique à celle observée dans toutes les cellules de la colonie. La même anomalie est retrouvée dans les cellules érythroïdes, granuleuses, lymphocytaires B ou mégacaryocytaires).

Par ces mêmes techniques cytogénétiques on a démontré qu' une anomalie induite dans le greffon est retrouvée quelques mois plus tard dans certains lymphocytes T de la souris.

La CFU-S est donc réellement totipotente. Elle est de plus douée d'autorenouvellement puisque l'injection d'une colonie splénique à une nouvelle souris irradiée permet la reconstitution de l'hématopoïèse de cette souris.

3 - Chez l'humain:

L'existence des cellules souches primitives est prouvée par la pathologie et par les techniques de cultures de moelle in vitro.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une maladie caractérisée par une anomalie chromosomique acquise (dite chromosome de Philadelphie). Cette anomalie est retrouvée dans toutes les lignées hématopoïétiques. Elle n'est pas retrouvée dans les cellules non hématopoïétiques.

Les femmes hétérozygotes pour l'enzyme G6PD possèdent dans toutes les cellules de leur organisme soit l'isoenzyme A soit l'isoenzyme B (50% des cellules ont un isoenzyme, 50% l'autre isoenzyme). Lorsque ces femmes sont atteintes de certaines pathologies de l'hématopoïèse on a pu montrer que toutes les cellules hématopoïétiques étaient clonales, possédant soit l'isoenzyme A (100% des cellules) soit l'isoenzyme B (100% des cellules). Chez les mêmes patientes les cellules non hématopoïétiques (par exemple les cellules de la peau) restent réparties à 50% d'entre elles avec l'isoenzyme A et 50% avec l'isoenzyme B.

L'exploration et la quantification in vitro des cellules souches primitives reste difficile. Elle fait appel à des techniques de cultures en milieu liquide longues (1 mois).

4 - Caractéristiques:

Les cellules souches totipotentes:

• Sont localisées dans la moelle osseuse mais certaines peuvent passer de façon temporaire dans le sang.
• Ne représentent qu'un faible pourcentage des cellules médullaires (0,01 à 0,05%).
• Ne sont pas identifiables morphologiquement (elles ressemblent à des petits lymphocytes).
• Sont pour la plupart en dehors du cycle cellulaire en G0.
• Possèdent certains marqueurs immunologiques :
CD 34+, Thy1+, CD 33 -,
Marqueurs de restriction de lignées négatifs,
Récepteur à la transferrine négatif,
HLA DR Low, Rhodamine 123 Low,
• Conservent leur propriétés après congélation à - 196° puis décongélation même de nombreux mois plus tard.

Les techniques de morphologie de la moelle osseuse (myélogramme, biopsie ostéomédullaire) ne sont pas adaptées pour observer et quantifier les cellules souches.
Les cellules souches peuvent être prélevées, concentrées puis congelées dans l'azote liquide. Lorsqu' une chimiothérapie très myélotoxique est nécessaire la reconstitution de l'hématopoïèse peut être réalisée par décongélation et réinjection de ces cellules souches au patient: c'est le principe de l'autogreffe de moelle osseuse.

La probabilité d'autorenouvellement pour une cellule souche doit être > 0,5 si l'on a besoin d'augmenter le nombre de cellules souches : cela est montré in vivo après chimiothérapie, reconstitution post-greffe, expansion des cellules souches durant la vie foetale.

A l'état normal la majorité des cellules souches sont au repos, en Go. Il y a conservation des cellules souches (objectivée par cultures) après exposition avec des agents cytolytiques spécifiques du cycle cellulaire comme la thymidine tritiée (3HTdR), le 5 Fluoro-uracile (FU), la 4-OH-cyclophosphamide, la cytosine arabinoside (ARAC).

Les progéniteurs :

La première différenciation d'une cellule souche totipotente après sa mise en cycle se fait vers la lignée lymphoïde ou vers la lignée myéloïde.

La cellule souche lymphoïde possède la potentialité de différenciation vers les deux types de lymphocytes (T et B).

La cellule souche myéloïde est appelée CFU-GEMM. Chaque nom de progéniteur est définie par l'association du préfixe CFU ("Colony Forming Unit") suivi de(s) lettre(s) qui caractérisent les lignées dont elle garde le potentiel de différenciation (GEMM = Granuleuse, Erythrocytaire, Macrophage et Mégacaryocytaire). Cette cellule va poursuivre son programme de différenciation et donner naissance à des progéniteurs encore plus engagés:

Nom de la cellule, Potentialité, Cellule terminale : voir schéma de l'hématopoïèse

CFU-GM Granulo-Macrophagique -----> P. Neutrophiles et Monocytes
CFU-G Granuleuse -----> Poly. neutrophiles
CFU-M Macrophagique -----> Monocytes
CFU-MK Mégacacaryocytaire -----> Plaquettes
CFU-Eo Eosinophile -----> Poly. éosinophiles
CFU-B Basophile -----> Poly. basophiles
BFU-E (Burst Forming Unit)
Erythroïde -----> Hématies

Les progéniteurs perdent progressivement leur capacité d'autorenouvellement au fur et à mesure de leur avancement dans la différenciation. Ils restent peu nombreuses et non identifiables morphologiquement. Ils acquièrent les marqueurs immunologiques CD 33 et HLA-DR en plus du CD 34 déjà présent au stade de cellule souche totipotente. Ces déterminants antigéniques peuvent être reconnus par des anticorps monoclonaux.

Les techniques de cultures des progéniteurs hématopoïétiques en milieu semi-solide permettent de quantifier les CFU-GEMM, CFU-GM, BFU-E, CFU-E et CFU-MK. Elles sont utiles dans l'exploration de certaines hémopathies affectant les cellules souches et sont nécessaires pour apprécier le contenu des prélèvements de greffe de progéniteurs hématopoïétiques.

Les précurseurs :

Les précurseurs hématopoïétiques sont les premières cellules morphologiquement identifiables de chaque lignée. Ce ne sont plus des cellules souches car elles ont perdus toute capacité d'autorenouvellement. Le compartiment des précurseurs a pour buts la multiplication et la maturation cellulaire. Les précurseurs les plus immatures sont les myéloblastes (--> polynucléaires), les proérythroblastes (--> hématies), les mégacaryoblastes (--> plaquettes), les lymphoblastes (--> lymphocytes) et les monoblastes (--> monocytes). Ils sont localisés dans la moelle osseuse et explorés par les techniques de ponction-aspiration (myélogramme) et de biopsie (BOM = biopsie ostéomédullaire) de la moelle.

o La maturation:

Divers stades cytologiques sont observés dans chaque lignée pour aboutir aux cellules terminales fonctionnelles. Ces stades sont décrits dans les chapitres sur l'érythropoïèse et la granulopoïèse.

Les modifications morphologiques communes et générales liées à la maturation sont:
la diminution de la taille cellulaire,
la diminution du rapport nucléo-cytoplasmique,
la disparition des nucléoles,
la condensation de la chromatine.

La maturation de chaque lignée induit également des modifications spécifiques:
du noyau (par ex: polylobulation dans la lignée granuleuse),
du cytoplasme (par ex: granulations spécifiques de la lignée granuleuse),
de la membrane (apparition de protéines membranaires spécifiques reconnaissables par anticorps monoclonaux).

o La multiplication:

L'efficacité et le rendement de l'hématopoïèse seraient très faibles si à chaque précurseur ne correspondait qu'un seul élément figuré mature. Aussi, parallèlement à la maturation, chaque stade cytologique correspond à une division cellulaire. Selon les lignées il se produit ainsi entre 3 et 5 mitoses de sorte qu'un précurseur peut donner naissance à 32 cellules filles.

Dans les précurseurs mégacaryocytaires la situation est très particulière: il n'y pas de division cellulaire mais une endomitose à l'intérieur des mégacaryocytes, la cellule doublant chaque fois son ADN. Les plaquettes sont des fragments de cytoplasme du mégacaryocyte qui seront libérées au moment de la mort de ce précurseur.

Les cellules matures :

L'ensemble de l'hématopoïèse a lieu dans la moelle osseuse. Seules les cellules terminales, matures et fonctionnelles, vont passer dans le sang : polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles, hématies, plaquettes, lymphocytes et monocytes. Pour la plupart de ces cellules le sang ne représente qu'un lieu de passage et de transport entre leur lieu de production (la moelle) et le lieu de leurs fonctions (les tissus). Les lymphocytes et les monocytes seront de plus capables de nouvelles différenciations après leur séjour sanguin.

Régulation :

Les cellules souches de la moelle constituent la base indispensable à une hématopoïèse efficace. Trois éléments jouent également un rôle important pour obtenir une hématopoïèse correcte et régulée: le microenvironnement médullaire, certaines vitamines et oligoéléments, les facteurs de croissance.

1 - Le microenvironnement médullaire participe à l'organisation générale de la moelle. Il donne aux cellules souches les conditions anatomiques et intercellulaires satisfaisantes pour assurer l'hématopoïèse.
Le stroma médullaire est formé de différent types de cellules: fibroblastes, cellules endothéliales, macrophages, cellules épithéliales et adipocytes. Ces cellules du stroma sont organisées au sein des logettes hématopoïétiques. Elles sécrètent des matrices extracellulaires et des facteurs de croissance. Les matrices extracellulaires permettent l'adhésion des cellules souches en particulier grâce au collagène.

2 - Des vitamines et oligoéléments sont indispensables à l'hématopoïèse:

Certains agissent sur l'ensemble des lignées cellulaires. C'est le cas de la vitamine B12 et de l'acide folique qui sont nécessaires à la synthèse de l'ADN et donc à la division cellulaire. Ces vitamines sont dites antimégaloblastiques. Leur déficit entraînera des anomalies de formation dans toutes les lignées.
D'autres sont nécessaires à la fabrication de protéines spécifiques de lignées. C'est le cas du fer, indispensable à l'érythropoïèse pour la synthèse de l'hémoglobine.

3 - Les facteurs de croissance : L'étude des cellules souches par culture de moelle in vitro a montré la nécessité de "facteurs de croissance hématopoïétiques" pour la survie, la différenciation, la multiplication et la maturation des cellules de l'hématopoïèse. Le premier facteur connu a été l'érythropoïétine (EPO). Depuis quelques années de nombreux autres facteurs ont été découverts, clonés et synthétisés. Leur rôle exact dans l'hématopoïèse est de mieux en mieux défini. Ils permettent de grands espoirs dans le traitement des maladies de l'hématopoïèse et certains sont déjà utilisés en thérapeutique.

Les facteurs de croissance hématopoïétiques sont des glycoprotéines agissant comme des "hormones hématopoïétiques". Cependant, à l'exception de l'EPO, elles sont synthétisées par un grand nombre de cellules présentes dans divers organes: cellules endothéliales, fibroblastes, monocytes / macrophages, lymphocytes. Elles ont aussi le nom de cytokines et pour celles synthétisées par les lymphocytes, de lymphokines et interleukines (IL). Ces cytokines reconnaissent leurs cellules cibles par l'intermédiaire de récepteurs membranaires spécifiques. On distingue schématiquement 3 types de facteurs de croissance selon leur lieu d'action au cours de l'hématopoïèse:

o Les facteurs de promotion:
Ce sont principalement l' IL 1, l' IL 4, l’ IL 6 et le SCF (Stem Cell Factor).
Ils augmentent le nombre de cellules souches en cycle cellulaire,
Ils sensibilisent les cellules souches totipotentes à l'action des autres facteurs de croissance.

o Les facteurs multipotents:
Ce sont principalement l' IL 3 et le GM-CSF (CSF = Colony Stimulating Factor).
Ils agissent sur les cellules souches les plus immatures après sensibilisation par les facteurs de promotion et ils permettent la survie et la différenciation des cellules souches.

o Les facteurs restreints:
Ils agissent sur les cellules souches engagées et favorisent la multiplication cellulaire et la maturation des précurseurs.
Ce sont principalement : le G-CSF (lignée granuleuse neutrophile),
le M-CSF (lignée monocytaire),
l'IL 5 (lignée granuleuse éosinophile),
l'IL 4 (lignée granuleuse basophile),
l'IL 6 (lignée mégacaryocytaire),
l'EPO (lignée érythroïde)
la TPO (thrombopoïétine, mégacaryocytaire)

Les points importants :

• Après la naissance, l’hématopoïèse normale humaine a lieu dans la moelle osseuse.

• Les cellules souches totipotentes peuvent être à l’origine de toutes les lignées hématopoïétiques.

• Les cellules souches ne sont pas identifiables morphologiquement.

• Les cellules souches possèdent le marqueur immunologique CD34.

• Les cellules souches conservent leur capacité de reconstitution de l’hématopoïèse après congélation à - 196°.

• Les progéniteurs sont explorés par des techniques de culture.

• Les précurseurs sont les premières cellules morphologiquement identifiables de chaque lignée.

• Les précurseurs sont explorés par le myélogramme et la biopsie ostéo-médullaire.